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富氢水的功效_富氢水对胰腺炎及肺组织氧化的应激反应的影响

发表时间:2016/03/05浏览量:1379

  富氢水对重症急性胰腺炎大鼠血清炎症细胞因子及肺组织氧化应激反应的影响


  杨培  冷波  李波  曾新 桃罗华  

  中华临床医师杂志(电子版)2015年9月第9卷第18期ChinJClinicians(ElectronicEdition),September15,2015,Vol.9,No.18

  【摘要】目的探讨静脉注射富氢水(HRS)是否能减轻牛磺胆酸钠诱导的重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肺组织氧化应激反应,抑制炎症细胞因子。方法将54只健康SD雄性大鼠随机分成假手术组(Sham组)、模型组(SAP+NS组)和氢水处理组(SAP+HRS组),各组再按时间点分成6h、12h、24h三个亚组,每个时间点处死6只大鼠。检测血清TNF-α、IL-1β含量;测定肺组织中髓过氧化物酶(MPO)活性以及TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达水平。结果(1)SAP+NS组和SAP+HRS组血清中TNF-α、IL-1β含量、肺组织中MPO活性、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA的表达在6h、12h、24h各个时间点均高于Sham组(P<0.05)。(2)SAP+HRS组与SAP+NS组比较,SAP+HRS组血清TNF-α含量、肺组织TNF-αmRNA在各个时间点均低于SAP+NS组。血清IL-1β含量、肺组织中MPO活性、IL-1βmRNA表达在6h时两组间无统计学差异,但在12h、24h时SAP+HRS组均低于SAP+NS组(P<0.05)。结论静脉注射HRS能减轻牛磺胆酸钠诱导的SAP大鼠肺组织氧化应激反应,降低炎症细胞因子的水平。

  【关键词】氧化性应激;重症急性胰腺炎;富氢水;炎症细胞因子

  重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitis,SAP)早期可诱发多器官功能衰竭。急性胰腺炎相关性肺损伤(acutepancreatitisassociatedlunginjury,APALI)是SAP最常见的并发症之一,常发展为急性呼吸窘迫综合征,是SAP早期死亡的主要原因[1]。研究表明,氧化应激及炎症细胞因子的激活在其中起着至关重要的作用[2]。因此,抗氧化应激、降低炎症细胞因子治疗可能是减轻SAP及APALI病情发展的重要手段。本实验通过建立大鼠SAP模型,探讨静脉注射富氢水(hydrogen-richsaline,HRS)是否能够减轻肺组织氧化应激反应及炎症细胞因子的水平。

  材料与方法

  一、材料

  1.实验动物及分组:SPF级健康成年雄性SD大鼠(泸州医学院实验动物饲养中心提供),体重200~250g,采用随机数字表法随机分为假手术组(Sham组)、模型组(SAP+NS组)及富氢水处理组(SAP+HRS组),每组18只。各组再分成处理后6h、12h、24h三个时间点,各6只大鼠。2.主要仪器和试剂:DH-300超高纯度氢气发生器(广州深华生物技术有限公司)、大鼠TNF-α、IL-1β试剂盒(Bender公司)、髓过氧化物酶试剂盒(南京建成科技有限公司)、PCR试剂盒(北京天根)、逆转录试剂盒(大连宝生物)。

  二、实验方法

  1.实验动物模型的建立:假手术组大鼠开腹后翻动十二指肠并触摸胰腺数次,随即关腹,不做其他处理。采用胆胰管逆行缓慢注入5%无菌牛磺胆酸钠(lml/kg,0.1ml/min)的方法制备大鼠SAP模型[3]。模型组和氢水处理组在大鼠SAP模型建模成功后1h分别经尾静脉注射生理盐水或氢饱和生理盐水(5ml/kg体重)。

  2.标本采集:按规定时间点处死大鼠。心脏采血3~4ml,4°C、12000r/min低温高速离心得血清1.5~2.0ml,-20°C保存备用。大鼠右肺中叶置于液氮中,-80°C保存,分别用于髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和TNF-αmRNA、IL-1βmRNA等分子生物学检测。

  三、观测指标

  1.血清TNF-α、IL-1β浓度:采用ELISA法测定血清中TNF-α、IL-1β浓度,步骤如下:(1)血清样本的采集:每组在各时间点(6h、12h、24h)2%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内注射麻醉后处死相应大鼠,大鼠处死前心脏采血3~4ml,4°C、12000r/min低温高速离心得血清1.5~2.0ml,-20°C保存备用。(2)标准品的稀释:从4°C冰箱取出试剂盒,开启试剂盒之前在室温平衡30min。标准品稀释液振荡混匀,37°C温育60min。(3)洗涤和显色:揭掉封板膜,弃去液体,甩干,再每孔加满稀释的洗涤液(浓缩洗涤液∶蒸馏水1∶19),静置30s后弃去,重复5次,拍干。再依次加入显色剂A50μl和显色剂B50μl,振荡混匀,37°C避光显色10min。(4)终止和测定:每孔加终止液50μl,终止反应。在加终止液后10min以内,以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。(5)计算:以标准品浓度及对应OD值作标准曲线并计算直线回归方程,再以样品OD值代入回归方程计算对应的样品浓度。

  2.肺组织中MPO活性测定:将肺组织制备成组织匀浆,采用分光光度计法测定肺组织中MPO活性,步骤如下:(1)准确称取肺组织重量,以配好的试剂二溶液为匀浆介质,按重量体积比为1∶19加匀浆介质制备成5%的组织匀浆。(2)取5%肺组织匀浆0.45ml加试剂三0.05ml,充分混匀后37°C水浴15min。(3)在各管中加入试剂七0.05ml,混匀,60°C水浴10min,取出后立即在460nm处,1cm光径,蒸馏水调零,测定各管吸光度值。(4)计算酶活力单位定义:每克组织湿片在37°C反应体系中H2O2被分解成为1μmol为1个酶活力单位。计算公式:MPO活力(U/克肺湿片)=(测定管OD值-对照管OD值)/11.3×取样量(g)。

  3.肺组织中TNF-αmRNA、IL-1βmRNA的表达:采用荧光定量PCR法检测,主要步骤如下:提取肺组织匀浆中总RNA;反转录合成cDNA;进行荧光定量PCR。

  四、统计学分析

  所收集的数据采用均数±标准差(sx±)表示,运用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学处理;根据适用条件,样本均数的比较采用方差分析(SNK-q检验);取双侧α=0.05为标准。若P<0.05,则差异有统计学意义。

  结果

  一、血清中TNF-α的浓度变化SAP+NS组和SAP+HRS组大鼠血清中TNF-α含量在6h、12h、24h三个时间点均高于Sham组,但SAP+HRS组均低于SAP+NS组,差异有统计学意义(表1,图1)




  二、血清中IL-1β的浓度变化

  SAP+NS组和SAP+HRS组大鼠血清中IL-1β含量在6h、12h、24h三个时间点,均高于Sham组。SAP+HRS组与SAP+NS组比较,6h时SAP+HRS组略高于SAP+NS组,但差异无统计学意义(P>0.05);12h、24h时SAP+HRS组均低于SAP+NS组,差异有统计学意义,见表1和图1。

  三、肺组织中MPO活性

  在6h、12h、24h三个时间点,SAP+NS组和SAP+HRS组肺组织MPO含量均高于Sham组(P<0.05)。SAP+HRS组与SAP+NS组比较,6h时两组无统计学差异(P>0.05),12h、24h时SAP+HRS组均低于SAP+NS组(P<0.05),见表2和图2。



表2各组肺组织髓过氧化物酶活性比较(U/g,sx±)


  四、肺组织中TNF-αmRNA、IL-1βmRNA的表达

  在6h、12h、24h三个时间点,SAP+NS组和SAP+HRS组大鼠肺组织中TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达水平均高于Sham组(P<0.05)。SAP+HRS组与SAP+NS组比较,各时间点SAP+HRS组TNF-αmRNA均低于SAP+NS组(P<0.05);6h时两组IL-1βmRNA差异无统计学意义(P>0.05);12h、24h时SAP+HRS组IL-1βmRNA均明显低于SAP+NS组(P<0.05),见表3和图3


  讨论

  SAP时APALI的发生率高达60%~70%,其中继发急性呼吸窘迫综合征者占20%。近年虽不断有新的治疗方法出现,但APALI仍是SAP早期最严重的并发症之一。APALI的发病机制复杂,目前尚未完全明确。既往研究表明,大量中性粒细胞在肺内聚集、黏附并促进炎性介质释放导致肺血管内皮损伤是APALI的重要病理特征。氧化应激反应在APALI早期已发生,通过产生大量氧自由基参与到APALI发生、发展过程中,由此推测抗氧化应激可能是改善APALI的一种有效途径。

  TNF-α、IL-1β在SAP炎症反应中扮演重要角色,并对炎症效应起放大作用,可激活肺内皮细胞,促使其上调细胞间黏附分子(如ICAM-1等)。血液中的中性粒细胞借助ICAM-1等黏附分子黏附于微血管内皮细胞表面,跨血管迁移于炎症部位积聚,促进并加重急性肺损伤的进展。因此,阻止炎症因子的过度产生,有利于减轻急性肺损伤模型小鼠肺损伤的程度。

  2007年日本学者Ohsawa等[8]发现氢气具有选择性抗氧化作用,可以选择性中和毒性作用强的羟自由基和亚硝酸阴离子,而后两者是氧化应激的重要介质,目前体内尚未找到特异性清除途径。该研究迅速引起国内外学者的广泛关注,掀起了研究氢分子生物学的热潮。而后在肝、肾、心肌、脑、小肠等器官的缺血再灌注模型中,也相继发现氢气在细胞保护和脏器损伤防护中发挥着明显抗氧化和抗炎作用。与其他抗氧化剂相比,氢具有明显的优势:比如无毒,不干扰机体正常的代谢,易于扩散进入细胞,使用方便等,具有巨大的应用潜能。

  本实验在建立大鼠SAP模型的基础上,经尾静脉注射氢饱和生理盐水(即富氢水,HRS)观察其治疗效果。结果显示SAP+HRS组与SAP+NS组比较,在注射HRS后6h,肺组织中MPO活性无明显差异,随着时间的推移,在注射后12h、24h时SAP+HRS组MPO活性均低于SAP+NS组。MPO是中性粒细胞的特异性标志物,能够反映中性粒细胞集聚及炎症损伤程度,同时它具有使过氧化氢还原的能力,是清除多形核白细胞膜系统产生的氧自由基所必需的酶之一,组织中MPO活性增加提示大量氧自由基的产生。因此,我们的实验结果表明HRS对肺组织中中性粒细胞的过度激活、浸润和聚集有明显的抑制作用,从而抑制氧化应激反应。炎症细胞因子TNF-α、IL-1β在血清中含量结果显示,SAP+HRS组在6h、12h、24h时血清中TNF-α的含量均低于SAP+NS组,差异有统计学意义,表明HRS对TNF-α有明显抑制作用;SAP+HRS组在6h时血清中IL-1β含量与SAP+NS组无明显差异,随着时间的变化,在12h、24h时均低于SAP+NS组,表明HRS对IL-1β也有抑制作用。同时,在对肺组织中TNF-α、IL-1β的核酸水平(TNF-αmRNA、IL-1βmRNA)进行检测时发现,SAP+HRS组在6h、12h、24h时肺组织中TNF-αmRNA的表达均低于SAP+NS组,表明HRS可抑制TNF-αmRNA在肺组织中的合成;SAP+HRS组在6h时肺组织中IL-1βmRNA表达与SAP+NS组无明显差异,随着时间的延长,12h、24h时均低于SAP+NS组,表明HRS对肺组织中IL-1βmRNA合成也有抑制作用。

  综上所述,本实验发现静脉注射HRS对肺组织中MPO活性、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA水平以及血清中炎症因子TNF-α、IL-1β含量具有明显抑制作用,可能对APALI具有治疗作用,但其具体的作用机制尚不清楚,有待从细胞信号传递层面更深入的进行研究。

  参考文献

  [1]ChooklinS.Pathogenicaspectsofpulmonarycomplicationsinacutepancreatitispatients

[J].HepatobiliaryPancreatDisInt,2009,8(2):186-192.

  [2]KatherineC,MarkTGladwin.Thehydrogenhighwaytoreperfusiontherapy[J].NatMed,2007,13

(6):673-674.

  [3]BluthMH,PatelSA,DieckgraefeBK,etal.Pancreaticregeneratingprotein(regI)

andregIreceptormRNAareupregulatedinratpancreasafterinductionofacutepancreatitis

[J].WorldJGastroenterol,2006,12(28):4511-4516.

  [4]PastorCM,MatthayMA,FrossardJL.Pancreatitis-associatedacutelunginjury:newinsights[J].Chest,2003,124(6):2341-2351.

  [5]ElderAS,SacconeGT,DixonDL.Lunginjuryinacutepancreatitis:mechanismsunderlyingaugmen

tedsecondaryinjury[J].Pancreatology,2012,12(1):49-56.

  


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